摘要：
目的 探讨西维来司钠是否能够通过抑制中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)进而减少黏蛋白 5AC(MUC5AC)在肝内胆管上皮细胞中的表达,为治疗肝内胆管结石(IBDS)提供新的潜在治疗思路.方法 ①生信分析:基于基因表达数据库(GEO)对胆结石及胆囊炎的测序数据进行差异基因分析,筛选中性粒细胞及黏蛋白相关的显著差异基因,使用基因与蛋白质相互作用检索数据库(STRING)进行蛋白互作分析,以预测NE基因与MUC5AC是否存在互作关系.②动物实验:将 18 只雄性SD大鼠按随机数字表法分为假手术组、胆管炎模型组和西维来司钠治疗组,每组 6 只.结合预实验于大鼠右前叶肝脏一次性注射 1.25 mg/kg脂多糖(LPS)建立胆管炎大鼠模型;假手术组肝脏注射等体积生理盐水.建模后,西维来司钠治疗组尾静脉注射西维来司钠 100 mg/kg;假手术组和胆管炎模型组尾静脉注射等体积生理盐水;每日 1 次,连续给药 5 d.2 周后处死大鼠取肝胆管组织,光镜下观察肝胆管组织病理学改变;免疫组织化学染色检测肝胆管组织NE和MUC5AC表达;蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)检测肝胆管组织NE、MUC5AC、Toll样受体 4(TLR4)的蛋白表达.③ 细胞实验:将原代人肝内胆管上皮细胞株(HiBEpiC)传代后分为空白对照组、NE组(10 nmol/L NE)、NE+西维来司钠低剂量组(10 nmol/L NE+1×10-8 g/L西维来司钠 1 mL)、NE+西维来司钠中剂量组(10 nmol/L NE+1×10-7 g/L西维来司钠 1 mL)、NE+西维来司钠高剂量组(10 nmol/L NE+1×10-6 g/L西维来司钠 1mL).培养 48h后收集细胞,行 5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶核苷(EdU)检测细胞增殖活性;酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western blotting检测细胞MUC5AC的表达.结果 ① 生信分析:NE基因(ELANE)与MUC5AC存在互作关系.② 动物实验:光镜下显示,胆管炎模型组肝细胞水肿,肝细胞呈弥漫性点、灶状坏死,汇管区纤维组织及肝内胆管增生与炎症细胞浸润;西维来司钠治疗组肝小叶结构清晰,周围炎症细胞浸润程度较胆管炎模型组减轻.免疫组织化学染色显示,胆管炎模型组NE和MUC5AC较假手术组明显高表达,西维来司钠治疗组NE和MUC5AC表达较胆管炎模型组有所下降[NE(A值):5.23±2.02 比 116.67±23.06,MUC5AC(A值):5.40±3.09比23.81±7.09,均P＜0.05].Western blotting检测结果显示,胆管炎模型组肝胆管组织NE、MUC5AC和TLR4 的蛋白表达均较假手术组显著升高;西维来司钠治疗组肝胆管组织NE、MUC5AC和TLR4 的蛋白表达较胆管炎模型组显著下降(NE/β-actin:0.38±0.04比0.70±0.10,MUC5AC/β-actin:0.37±0.03比0.61±0.05,TLR4/β-actin:0.39±0.10 比 0.93±0.15,均P＜0.05).③细胞实验:荧光显微镜下显示,各组HiBEpiC细胞的增殖状态良好,阳性细胞比例无明显差异.ELISA法和Western blotting检测结果显示,NE组细胞MUC5AC表达较空白对照组显著升高;NE+西维来司钠各剂量组细胞MUC5AC表达较NE组显著下降,且随西维来司钠浓度升高呈下降趋势,以高剂量组变化最明显[MUC5AC(μg/L):3.46±0.20 比 6.33±0.52,MUC5AC/β-actin:0.45±0.07 比 1.75±0.10,均P＜0.05].结论 LPS作用后可致胆管炎大鼠NE、MUC5AC表达上调,西维来司钠可通过抑制NE减少肝内胆管上皮细胞MUC5AC的表达,为IBDS的治疗提供新的方向.
