摘要：
目的 探讨腺苷酸环化酶(ADCY)2/4/5/8在皮肤恶性黑色素瘤中的表达、作用及功能机制,验证ADCY2/4/5/8对黑色素瘤细胞A375增殖和迁移的影响.方法 通过基因表达谱分析(GEPIA)和人类蛋白质图谱(HPA)数据库分析ADCY2/4/5/8 mRNA和蛋白的表达以及基因表达与预后的关联,UALCAN、DeMth和cBioPortal数据库分析ADCY2/4/5/8基因甲基化和突变状态,DAVID和STRING数据库对ADCY2/4/5/8基因进行基因富集分析和通路分析.qPCR检测黑色素瘤A375细胞及色素痣FF细胞中ADCY2/4/5/8 mRNA的相对表达.将A375细胞分为实验组和对照组分别转染ADCY2/4/5/8过表达质粒和对照空载体,采用CCK8和Transwell实验检测过表达ADCY2/4/5/8对A375细胞增殖和迁移的影响,qPCR检测过表达ADCY2/4/5/8基因对A375细胞增殖、迁移相关基因mRNA相对表达的影响,Western印迹法检测过表达ADCY2/4/5/8基因对A375细胞环磷酸腺苷(cAMP)信号通路的影响.组间比较采用单因素方差分析和重复测量方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验.结果 GEPIA数据库分析显示,558例正常组织中,ADCY2、ADCY4、ADCY5和ADCY8 mRNA在黑色素瘤组织(n=461)中表达下调(P＜0.01).对GEPIA数据库中黑色素瘤ADCY2/4/5/8 mRNA的表达分层分析显示,ADCY2 mRNA(P=0.015)和ADCY8 mRNA(P=0.038)的表达与肿瘤分期相关,表达越低,分期越晚.HPA数据库30例黑色素瘤临床样本和正常组织中,ADCY2/4/5/8蛋白在黑色素瘤组织较正常组织表达降低(P＜0.001).UALCAN和DeMth数据库分析显示,与正常组织相比,ADCY2/4/5/8在黑色素瘤组织和转移性黑色素瘤组织中甲基化水平升高(P＜0.001).DAVID、STRING分析示,ADCY2/4/5/8基因可能通过激活cAMP信号通路抑制细胞增殖和迁移.qPCR检测显示,A375细胞中ADCY2/4/5/8 mRNA的相对表达均低于FF细胞.CCK8实验显示,培养48、72 h时,过表达ADCY2/4/5/8实验组A375细胞存活率均低于对照组(均P＜0.05).Transwell实验显示,过表达ADCY2/4/5/8实验组A375细胞迁移数均低于对照组(均P＜0.01).qPCR结果显示,过表达ADCY2/4/5/8实验组A375细胞上皮钙黏蛋白mRNA相对表达高于对照组,Ki67、波形蛋白、神经钙黏蛋白和基质金属蛋白酶2 mRNA相对表达低于对照组(均P＜0.001).Western印迹实验显示,过表达ADCY2/4/5/8实验组A375细胞cAMP和磷酸化蛋白激酶A(p-PKA)表达高于对照组(P＜0.001),实验组与对照组细胞PKA蛋白表达水平差异无统计学意义(P＞0.05).结论 ADCY2/4/5/8在黑色素瘤组织中低表达,过表达时可抑制黑色素瘤细胞的增殖和迁移,可能作为潜在的抑癌基因参与黑色素瘤的进展.
