本发明涉及一种检测人基质金属蛋白酶-12活性的荧光多肽底物及检测方法。该荧光多肽底物包括如PeptideⅠ所示的氨基酸序列,并且其氨基酸序列的第1位异亮氨酸结合荧光基团5-羧基荧光素,第12位的赖氨酸结合荧光猝灭基团5-羧基四甲基若丹明。本发明所述的荧光多肽底物与MMP-12反应的酶促反应动力学常数K m 为35μM,k cat /K m :35428M -1 .s -1 ,其是MMP-9酶切本发明荧光多肽底物k cat /K m 的6.4倍,MMP-1、3与本发明所述的荧光多肽底物几乎无反应。本发明所述检测人血清MMP-12活性的方法,操作简便,快速,具有一定的特异性,具有良好的应用前景。