摘要：
目的 构建含BMP-2和TGF-β3基因的重组腺病毒载体,双基因共转染滇南小耳猪BMSCs并检测其表达,为组织工程软骨支架提供改良的种子细胞. 方法 用PCR方法扩增人BMP-2和TGF-β3目的基因,将2个基因亚克隆至穿梭载体pEC3.1(+)中,构建pEC-GIE3.1-BMP-2和pEC-GIE3.1-TGF-β3重组质粒,通过体外同源重组反应将pEC-GIE3.1-BMP-2、pEC-GIE3.1-TGF-β3重组至腺病毒骨架质粒pGSadeno中,构建重组腺病毒表达质粒pGSadeno-BMP-2、pGSadeno-TGF-β3,线性化后转染HEK293细胞进行包装,获得重组腺病毒Ad-BMP-2和Ad-TGF-β3.取成年滇南小耳猪的骨髓,采用离心加贴壁法分离BMSCs,分别用基因Ad-BMP-2(A组)、Ad-TGF-β3(B组)和Ad-BMP-2+ Ad-TGF-β3(C组)转染,以未转染细胞作为对照(D组).采用免疫荧光、Western blot、PCR检测目的基因和蛋白表达,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察成软骨分化情况. 结果 Ad-BMP-2和Ad-TGF-β3经PCR及测序鉴定正确,带BMP-2、TGF-β3基因的载体在HEK293细胞中包装成功,病毒滴度分别为5.6×108、1.6×108 pfu/mL.双基因共转染滇南小耳猪BMSCs 72 h后,PCR示A组在310 bp处可见条带,B组在114 bp处可见条带,C组在310、114 bp处同时可见条带,D组未见目的条带表达;免疫荧光示A、B组细胞质内有分别有红色、绿色荧光表达,C组同时表达红色及绿色荧光,D组未见荧光表达;Western blot示A组在相对分子质量为18×103处有阳性条带,B组在50×103处有阳性条带,C组在18×103、50×103处同时可见条带,D组未见目的条带表达.Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示A、B、C组呈阳性,C组染色强于A、B组,D组染色呈阴性. 结论 成功构建含BMP-2和TGF-β3基因的重组腺病毒载体.Ad-BMP-2和Ad-TGF-β3双基因联合转染滇南小耳猪BMSCs后目的基因和蛋白均可成功表达,并促进BMSCs成软骨分化,可作为组织工程软骨研究的改良种子细胞.
