资源类型:
收录情况:
◇ 统计源期刊
◇ CSCD-E
文章类型:
机构:
[1]中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室,昆明,650118
[2]昆明医科大学附属第一医院骨科,昆明,650032
外科科室
骨科
昆明医科大学附属第一医院
出处:
ISSN:
关键词:
Mbd3基因
基因沉默
慢病毒载体
RNA干扰
摘要:
研究构建靶向抑制人Mbd3表达的shRNA慢病毒颗粒,感染人脐带间充质干细胞并用嘌呤霉素筛选获得Mbd3稳定下调的细胞系,为进一步探讨Mbd3在诱导型多潜能干细胞形成中的作用提供实验基础。研究根据Gene Bank中公布的Mbd3基因序列设计特异性siRNA干扰序列并合成可产生shRNA的双链DNA,经双酶切后克隆至pLVshRNA-EGFP(2A)Puro载体上构建慢病毒重组质粒,转化DH5α大肠杆菌PCR检测筛选阳性质粒,利用HEK293Ta包装产生含有Mbd3shRNA的慢病毒颗粒。通过RT-PCR和Western blot检测慢病毒感染人脐带间充质干细胞(hUC-MSC)后Mbd3的转录和蛋白表达情况,进一步检测重组慢病毒对Mbd3的沉默效果并筛选出最佳抑制效果的shRNA慢病毒载体。结果显示成功构建并筛选出下调Mbd3的最佳慢病毒干扰载体,慢病毒感染人脐带间充质干细胞48h后于荧光显微镜下可见绿色荧光,经嘌呤霉素筛选9 d后,RT-PCR检测Mbd3表达显著降低, Western blot检测Mbd3蛋白表达明显减少。说明构建的shRNA重组慢病毒包装成功,具有较高的感染活性,可有效抑制人脐带间充质干细胞Mbd3的表达,为后续研究脐带间充质干细胞跨胚层分化打下前期研究基础。
基金:
云南省重点新产品开发计划(2012AE001);;协和青年基金和中央高校基本科研业务费专项资金(33320140082);
第一作者:
第一作者机构:
[1]中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室,昆明,650118
推荐引用方式(GB/T 7714):
闫姗姗,周艳,李溪,等.下调人脐带间充质干细胞Mbd3基因shRNA慢病毒的构建及鉴定[J].生物学杂志.2015,32(03):15-20.