摘要：
目的:探索干扰小鼠GATA-3基因的慢病毒载体的构建与鉴别方法.方法:分析小鼠单个核细胞内GATA-3基因的编码区,设计并合成3条最佳动力学参数靶点干扰序列的单链oligo.利用PCR技术对合成的单链oligo进行拼接反应,将合成好的序列装入shRNA慢病毒载体并转化至感受态细胞DH5α,测序并鉴定重组克隆中的基因序列后构建shRNA-GATA-3表达载体.根据不同的干扰序列将慢病毒载体分为4组:siRNA-685(LV3-GATA-3-Mus-685)组、siRNA-1152(LV3-GATA-3-Mus-1152)组、siRNA-1615(LV3-GATA-3-Mus-1615)组和对照组.将shRNA载体分别与表达载体共转染入293T细胞,通过qPCR检测筛选出最优干扰序列.将筛选到最佳的LV3-GATA-3-Mus-1615干扰序列构建入慢病毒载体,用构建的慢病毒干扰载体和包装质粒共转染293T细胞,包装病毒,收集病毒原液,超速离心浓缩,并测定滴度.结果:克隆测序验证无误,慢病毒载体构建成功.siRNA-1615组GATe3 mRNA相对表达量(0.004)与siRNA-685组(0.009)、siRNA-1152组(0.009)和对照组(0.022)相比明显减少,LV3-GATA-3-Mus-1615为最佳的干扰序列.收集的病毒上清测定病毒的滴度为5×108 TU/ml.转染实验48 h后,荧光显微镜观察转染成功.结论:成功构建并鉴定小鼠GATA-3基因RNAi慢病毒载体.
