摘要：
目的:通过慢病毒载体介导的RNA干扰技术过表达和干扰肠上皮细胞热休克转录因子2(heat shock transcription factor 2,HSF2)表达,研究不同HSF2水平对肠上皮细胞凋亡和迁移的影响.方法:(1)选取HT-29(人结肠癌细胞株)作为研究材料,丁酸钠(设置不同时间点/浓度)诱导细胞凋亡,MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞凋亡、周期.按实验结果选取最佳丁酸钠浓度及时间位点;(2)慢病毒载体介导的RNA干扰技术过表达和干扰结肠上皮细胞HSF2表达;用倒置荧光显微镜、Western blot法检测目的基因在细胞中的转染效率;(3)细胞迁移实验(划痕法/Transwell小室)检测过表达和干扰HSF2后细胞迁移能力的改变;(4)经过表达和干扰HSF2后的细胞,给予丁酸钠诱导凋亡,MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞凋亡率、细胞周期.结果:(1)MTT实验结果显示:阴性对照组(NC组)的HT-29细胞增殖活性在实验观察期间(0-96 h)不断升高,48 h后,实验组的细胞对4个丁酸钠浓度组均表现出明显的生长抑制,相对于NC组之间差异具有统计学意义(P<0.01),故丁酸钠对HT-29细胞的生长抑制作用呈浓度、时间依赖性.流式细胞仪检测细胞凋亡率结果显示:NC组有少量凋亡,总凋亡率为0.548%±0.113%,而实验组经4个不同浓度丁酸钠处理48 h后,总凋亡率分别为51.588%±5.110%、77.732%±2.746%、90.115%±1.438%、94.247%±1.243%,与NC组之间差异具有统计学意义(P<0.01).而当丁酸钠浓度>2.5 mmol/L,凋亡率较1.25 mmol/L明显上升.细胞周期检测结果显示:与NC相比,1.25 mmol/L丁酸钠处理HT-29细胞48 h,G0/G1期HT-29细胞未显示出明显差异(P=1.00>0.05),即无明显细胞周期阻滞;而2.5、5.0、10 mmol/L以上浓度在各观察点均出现明显的细胞周期阻滞现象,呈明显的G1/G0期阻滞(P<0.01);(2)慢病毒载体转染效果检测:通过倒置荧光显微镜(×100)观察可发现,各组HT-29细胞经慢病毒载体转染后均有GFP表达,转染率达80%以上.用Western blot法检测结果显示:慢病毒构建载体能够在细胞中高效、稳定地过表达和干扰目的基因;(3)MTT法检测转染过表达和si RNA的HSF2细胞在丁酸钠诱导凋亡环境下活性变化,结果显示:过表达组细胞活性高于过表达对照组(P<0.05),干扰组的细胞活性低于干扰对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);(4)细胞迁移实验发现:过表达组的细胞迁移能力较NC组明显增加,而干扰组则明显降低(P<0.05);(5)过表达和干扰HSF2后丁酸钠诱导凋亡环境下细胞周期的影响:NC组以及使用慢病毒载体处理的5组之间,各时间点细胞周期分布差异均无统计学意义(P>0.05);(6)过表达和干扰HSF2后丁酸钠诱导凋亡环境下细胞凋亡率的变化:过表达组总凋亡率低于过表达对照组(P<0.05);干扰组总凋亡率高于干扰对照组(P<0.05).结论:细胞发生凋亡时,HSF2可能对肠上皮细胞起保护作用,提示HSF2可能通过调控细胞周期来实现对细胞增殖的影响,但也可能还有其他途径;HSF2可能在凋亡损伤时对肠上皮细胞起修复作用.
